复旦大学附属中山医院樊嘉院士、柯爱武副研究员、蔡加彬博士领衔的研究团队发现，对PD-1抑制剂有耐药性的肝细胞癌(HCC)上调表达转录因子ZFP64，随后ZFP64被蛋白磷酸化酶Cα(PKCα)活化，从而促进巨噬细胞集落刺激因子1(CSF1)表达;而CSF1又会招募并促进巨噬细胞极化为促癌的M2表型，导致HCC的免疫逃逸并对PD-1抑制剂产生耐药。使用蛋白激酶抑制剂Gö6976或仑伐替尼，可阻断PKCα/ZFP64/CSF1轴，恢复HCC对PD-1抑制剂的敏感性。(J Hepatol. 2022年2月24日在线版 DOI: 10.1016/j.jhep.2022.02.019)

为了探讨对PD-1抑制剂治疗耐药HCC的特征，研究者选取10例接受PD-1抑制剂治疗后疾病进展、7例部分缓解的患者肝脏活检样本进行了NGS测序。分析发现，ZFP64在疾病进展患者肿瘤组织中显著上调表达。在小鼠原位肿瘤模型中，若肿瘤细胞过表达ZFP64，则小鼠肿瘤生长更迅速，对PD-1抑制剂治疗反应更差。

在验证队列中，研究者发现ZFP64在肿瘤中显著上调，且ZFP64表达与肿瘤内浸润淋巴细胞的数量呈反比，ZFP64水平高与患者预后不良相关，提示ZFP64可能是引起HCC免疫逃逸以及PD-1抑制剂耐药的关键因素。

为了在体内环境探究ZFP64对肿瘤发生发展的影响，研究者使用一种能自发肝细胞癌的HBV转基因小鼠模型。实验结果显示，若使小鼠肝细胞过表达ZFP64，则HCC发生率、生长速度、转移率均显著增加。

对肿瘤微环境进行分析发现，肿瘤中巨噬细胞明显增多，主要是促癌的M2巨噬细胞;CD4+T以及CD8+T细胞显著减少。说明ZFP64可促进肿瘤的发生发展，且诱导形成免疫抑制性的肿瘤微环境。

研究者将巨噬细胞与ZFP64hi HCC细胞共培养，发现这可促使巨噬细胞上调表达CD206、CD163和Arg1等M2巨噬细胞的标志物，同时还上调表达免疫抑制细胞因子IL-10和TGF-β1;共培养后的巨噬细胞可强烈地抑制T细胞增殖与活化。趋化实验还发现ZFP64hi HCC促进巨噬细胞的趋化募集，提示ZFP64hi HCC可通过诱导巨噬细胞M2极化和促进巨噬细胞趋化募集两种机制，增加肿瘤内M2巨噬细胞数量。

因ZFP64是一种转录因子，或是它调控了某种重要基因表达，以此调控巨噬细胞。为证实这一猜测，研究者通过RNA测序及ChIP-seq技术结合细胞系实验，寻找ZFP64的靶基因，最终发现ZFP64可促进CSF1的转录激活。

研究者通过共培养实验发现，敲低肿瘤细胞的CSF1后，巨噬细胞的Arg1、IL-10和TGF-β1表达水平显著降低，且趋化运动也减少，提示ZFP64通过激活CSF1的转录，从而促进巨噬细胞的招募与M2极化。

研究者探究了ZFP64活性的调控机制，发现PKCα可磷酸化ZFP64第226位丝氨酸，从而促进ZFP64核定位与转录激活能力，PKCα、ZFP64和CSF1组成了一个完整的免疫逃逸信号轴。对临床队列的回顾性研究发现，HCC患者PKCα/ZFP64/CSF1轴的激活与不良预后相关，且与PD-1抑制剂治疗效果呈现负相关。

研究者尝试使用PKCα抑制剂Gö6976抑制这条信号轴发现，Gö6976单药治疗就可抑制肿瘤生长，并改善肿瘤免疫微环境。若将Gö6976与PD-1抑制剂联用，则可取得更好疗效。更重要的是，研究者发现使用已获批的多激酶抑制剂仑伐替尼与PD-1抑制剂联用，也能显著改善治疗效果。

既然CSF1是PKCα/ZFP64/CSF1轴的最终效应因子，那么抑制CSF1信号是否能发挥很好的效果?为了探讨这一可能性，研究者使用CSF1R抑制剂BLZ945对荷瘤小鼠进行治疗，发现单用BLZ945就能很好地抑制肿瘤生长，若将其与PD-1抑制剂联用，则可极大地改善PD-1抑制剂的疗效。

该研究揭示了在HCC中一种前所未知的PD-1抑制剂耐药机制，为预测PD-1抑制剂疗效提供了指标。研究发现使用已获批的仑伐替尼与PD-1抑制剂联合使用可克服耐药提高疗效，有非常重要的临床参考价值。(编译 胡静)