山东大学Zhang等研究开发的整合条形码免疫测定生物芯片与机器学习的平台，通过检测血清中小细胞外囊泡的9种蛋白质，对食管鳞状细胞癌的早期诊断准确率达90.8%，显著优于现有方法，为食管癌早期诊断提供了有力工具。（Adv Sci. 2025年7月7日在线版）

传统的食管癌筛查方法如内镜检查，有侵入性、成本高，需要专业人员操作，组织活检因样本获取困难和肿瘤时空异质性导致取样偏差。迫切需要侵入性更小的筛查方法，液体活检以其微创、安全且能克服肿瘤内异质性等优势引起关注，但常见游离DNA和游离蛋白在早期食管癌诊断中的敏感性不足20%。

研究者以食管鳞癌为疾病模型，开发了一种整合条形码免疫测定生物芯片与机器学习的平台，用于检测一组蛋白质组生物标志物，实现食管癌的早期诊断。

生物芯片从血清中捕获小细胞外囊泡，进行原位裂解，对包括EVs膜蛋白和内部蛋白在内的多种蛋白质进行定量分析，对273份多中心临床样本进行了检测，利用机器学习对验证集进行分析，构建出精确的食管鳞癌诊断模型。

该模型基于通过质谱分析差异表达蛋白确定的9种诊断性蛋白质生物标志物，在外部验证中准确率高达91.0%，检测早期食管鳞癌的准确率为90.8%，显著超过目前用于鳞癌的生物标志物仅14.4%的准确率。

研究者采用基于液相色谱-质谱（LC-MS）的4D数据非依赖采集（4D-DIA）方法，对12例食管鳞癌患者和18名健康对照者的血清小EVs进行蛋白质组学分析，识别出超过2000种小EVs蛋白，并根据差异表达和生物信息学意义筛选出14个潜在标志物。

在队列1的66例食管鳞癌患者和80名健康对照者中比较这些标志物的表达，利用机器学习探索蛋白质谱与临床表型的相关性，开发出食管鳞癌诊断模型，并优化其中9个标志物构建了9-DM模型，在区分食管鳞癌患者和健康对照者方面表现出色。同时，在包含47例食管鳞癌患者和20名健康人的外部测试集中验证了该机器学习模型的稳健性。

为高效捕获和检测小EVs，研究者开发了条形码微流控平台，整合了小EVs捕获、原位裂解和EVs蛋白检测功能。该平台使用氧化石墨烯量子点（GOQDs）修饰的基底，固定CD63、CD81和CD9的混合抗体以提高小EVs捕获效率，捕获效率在一定浓度范围内超过90%。

捕获后进行原位裂解，30分钟可使荧光信号降至背景水平。构建的抗体条形码芯片能同时检测60个样本，每个样本可检测14种蛋白质，检测限低至0.01~96.61 pg/mL，且性能稳定。

临床样本测试结果显示，队列1和队列2中食管鳞癌患者血清小EVs中14种蛋白质水平与健康对照者存在显著差异。与常用的鳞癌标志物SCC相比，这14种标志物表现出更好的诊断效能，基于它们的主成分分析能更明显地区分食管鳞状细胞癌患者和健康对照者，单个蛋白质标志物的AUC值在0.52~0.88，而SCC的AUC仅为0.51。

9-DM模型在测试集1中的准确率为88.4%，在测试集2中达到91.0%，在后续的队列3中也保持了83.3%的准确率（AUC 0.93），显示出良好的泛化能力。该模型在识别早期食管鳞癌患者方面表现强劲，在Ⅰ~Ⅱ期食管鳞癌患者和健康对照者队列中，总体准确率达90.8%。对结直肠癌、胃癌和乳腺癌患者血清样本的测试表明，9-DM模型能准确识别食管鳞癌患者，所选标志物和诊断模型具有特异性。蛋白质组学分析和免疫荧光分析也验证了所选生物标志物在食管鳞状细胞癌中的特异性表达。

该研究将细胞外囊泡蛋白分析与机器学习相结合，成功开发出的小EVs分析平台为多生物标志物检测方法的临床应用提供了有力工具，显著提升了食管鳞状细胞癌的早期诊断水平，也为其他疾病的相关研究和诊断方法开发提供了有益借鉴，为疾病的早期发现和治疗带来积极参考。 （编译 赵可心）