天津肿瘤医院 史振东 张瑾

乳腺癌是目前女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一。据2012年的统计学数据显示：全球大约有170万妇女被诊断为乳腺癌，死于该病的患者大约有52万人;而预计到2050年，乳腺癌新增患者数据将达320万，乳腺癌已成为当今社会的重大公共健康问题。三阴性乳腺癌约占全部乳腺癌总数的10%~20%，多发生于年轻女性。相比于其他类型的乳腺癌，具有肿瘤体积大、病理等级高、淋巴结更易受累、侵袭性及转移性更强等特点，并且由于其不表达激素受体及HER2，三阴性乳腺癌不能从内分泌治疗和针对HER2的靶向治疗中获益，患者更易发生远处转移且临床预后较差。乳腺癌的进展包括一系列复杂的级联事件，如肿瘤细胞的增殖、迁移、局部浸润、血管生成、循环系统内的生存及远处定殖进而形成转移瘤。因而，了解乳腺癌进展的关键分子机制及调控网络将为其选择有效的治疗方式提供依据。

小RNA是一种长度约20个核苷酸的非编码RNA，近年来被证实在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要的作用。它通过结合到其靶点mRNA 3’端非编码区域，从转录后水平抑制其表达。目前有研究发现：在非小细胞肺癌中miR-340可通过靶向一系列p27的负调控因子抑制肿瘤细胞的增殖并促进凋亡;此外，还可通过靶向CDK6、Cyclin-D1与Cyclin-D2抑制胶质母细胞瘤的生长。在乳腺癌中，miR-340可通过抑制c-Met发挥抗肿瘤作用，但其具体机制有待进一步验证。

近年来的研究发现，DNA甲基化和组蛋白修饰等表观遗传学机制在乳腺癌发生发展中发挥着重要的作用，并成为乳腺癌研究领域的热点内容。多梳抑制复合物(Polycomb Repression Complex 2，PRC2)是一种表观遗传调控因子，主要由EZH2、EED、SUZ12和RbAp46/48四种核心蛋白组成，其中EZH2(Enhancer of zeste homolog 2)是PRC2复合物的关键催化亚基，具有组蛋白甲基转移酶的活性。它可通过诱导组蛋白H3第27位赖氨酸发生三甲基化(H3K27me3)来沉默特定基因表达参与的一系列生物学过程，包括肿瘤发生、进展、干细胞特性维持等。此外，H3K27的三甲基化还可以通过招募DNA甲基转移酶(DNMT)进而参与DNA的甲基化发挥基因沉默作用。EZH2除了可以通过经典的PRC2依赖方式参与转录抑制外，目前有研究证实它还能以非PRC2依赖方式发挥转录激活作用。作为一种癌基因，越来越多的研究已证实，EZH2的过表达或突变存在于包括乳腺癌、前列腺癌、脑胶质瘤等多种恶性肿瘤中，并且其表达水平的升高与肿瘤的恶性程度及患者的不良预后存在显著的正相关。

在此研究中，天津肿瘤医院张瑾等首先利用荧光原位杂交(FISH)及免疫组化(IHC)分别检测了62例乳腺癌组织及肿瘤旁组织中的miR-340和EZH2表达水平。结果显示：在癌旁正常组织中，miR-340表达显著高于癌组织，而EZH2在肿瘤组织中的表达水平较高。半定量分析发现，miR-340表达与EZH2具有一定的负相关性(r=-0.42，P<0.01)。随后在细胞系中发现，相对于激素敏感型乳腺癌细胞(T47D和MCF-7)，在三阴性乳腺癌细胞系(Cal51/MDA-MB-231和MDA-MB-468)中，miR-340表达水平较低，而EZH2表达水平较高。后续的生物信息学分析发现，miR-340种子序列与EZH2 mRNAs的3’非编码区有结合位点，而荧光素酶报告实验则进一步证实了EZH2是miR-340的一个靶基因。

在体外，MTT及Colony形成实验表明：miR-340可抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-468的增殖能力;流式细胞术检测发现miR-340将肿瘤细胞抑制在了G0/G1期，并诱导了细胞凋亡;Transwell检测表明miR-340抑制了肿瘤细胞的侵袭及迁移能力;同时，荧光共聚焦实验发现，miR-340上调了EMT相关的上皮标志物E-cadherin的表达水平，而β-catenin的细胞核水平表达降低。此外，张瑾等还构建了MDA-MB-231的乳腺癌原位荷瘤模型，分别利用miR-340及其无义序列进行3周治疗。结果显示：与无义序列组相比，miR-340抑制了小鼠皮下肿瘤的生长，并且处死后获得的瘤块质量也显著低于无义序列组。研究者们又对获得的小鼠组织标本进行了免疫组化及荧光原位杂交检测，发现miR-340组与无义序列组相比的miR-340表达水平上调，而EZH2、MMP9、Ki-67的表达水平降低。

为进一步探讨可能的分子机制，研究者们利用蛋白印迹法检测了EZH2小分子抑制剂DZNep及miR-340 mimics转染后相关指标的表达水平。结果显示：DZNep组及miR-340 mimics组中DNMT1、H3K27me3、β-catenin、p-STAT3表达水平均降低，与此同时，miR-21表达水平降低，miR-200a/b的表达水平上调。同时结合前期研究结果发现：靶向EZH2后，miR-340一方面下调了DNMT1及H3K27me3的表达，逆转了miR-200a/b的表达沉默;另一方面，通过下调p-STAT3，抑制了miR-21的转录激活;miR-200a/b的表达上调及miR-21活性降低共同抑制了三阴性乳腺癌的进展。最终，研究者们确立了三阴性乳腺癌中以EZH2为核心的网络调控体系，为其靶向治疗提供了可能的靶点。